Determinação do padrão de distribuição de algumas moléculas envolvidas na somitogénese

Relatório de projecto no âmbito de Bolsa Universidade de Lisboa/Fundação Amadeu Dias (2008/2009)Laboratório: Biologia do Desenvolvimento – FCUL/CBAUniversidade de Lisboa; Fundação Amadeu Dia

Hitchhiking through the amnion/chorion: redefining the migratory route of primordial germ cells in chicken embryos

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Primordial germ cells (PGCs) are the founders of the gametes. They are one of the first discernible embryonic cell types which are set aside very early in the developing embryo. As it happens in other organisms, in chicken embryos, PGCs migrate from their extraembryonic location to combine with the somatic component of the gonad. An ingression of PGCs from the hypoblast into the vascular system, around stage HH8-10, was previously addressed using SSEA-1 as a marker for PGCs. Nonetheless, the isolation of the chicken vasa homolog (cvh), which is known to play a role in chicken germline, and the production of an antibody against VASA protein, permitted its use as a reliable marker to analyze the migration process of PGCs in chicken embryos. In this work we compared the specificity of VASA antibody with the specificity of SSEA-1 antibody for PGCs at different developmental stages. We concluded that SSEA-1 is not a specific marker for PGCs. Therefore we decided to characterize the position of PGCs, in different developmental stages, using VASA antibody. We identified the presence of PGCs in one structure that was not related with their migration in chicken embryos, or even in other animal model: the amnion/chorion. Taking advantage of the easiness of chicken embryos manipulation, we preformed a functional study to understand if amnion/chorion is having a role on PGCs migration. Our experiments demonstrated that embryos cultured with a modified “cornish pasty” method have a normal development, regarding the body structures and also the extra and intraembryonic vascular system. However the development of somatopleure is affected, and there is no separation between chorion and amnion or development of the amnion/chorion fold. The absence of PGCs in the genital ridges at stage HH17 and their presence in the somatopleure, allowed us to conclude that the developing amnion/chorion is involved in the migration process of PGCs.A formação de órgãos durante o desenvolvimento embrionário baseia-se na cooperação de diferentes tipos celulares. Algumas células são definidas a alguma distância do local onde o futuro órgão se formará. A migração celular é um fenómeno central em vários momentos do desenvolvimento embrionário permitindo que estas células se desloquem até à estrutura onde virão, mais tarde, a desempenhar o seu papel biológico correctamente. As células germinais primordiais (CGPs) são um dos primeiros tipos celulares a distinguirem-se no embrião. As CGPs constitutem as progenitoras dos gâmetas desempenhando, por isso, uma função fundamental nos organismos sexuados. Depois de especificadas as CGPs são mantidas longe da gónada, até ao momento em que os movimentos celulares embrionários estabilizam, o que permite que mantenham a sua identidade. Mais tarde, as células iniciam a sua migração em direcção às gónadas, onde encontrarão as células somáticas ali presentes que lhes servirão de suporte nutritivo, o que permitirá seu correcto desenvolvimento. Ao atingirem a gónada esta fica apta a produzir gâmetas femininos ou masculinos, processo que se completará na puberdade. Os gâmetas são responsáveis por uma parte da variabilidade dos organismos sexuados, sendo por isso células com um papel muito importante tanto ao nível biológico individual como ao nível evolutivo. No caso da ave, a migração das CGPs ocorre da parte anterior extraembrionária para uma parte posterior do embrião, as cristas genitais, local onde se formará a futura gónada. Inicialmente, no estádio X (Eyal-Giladi and Kochav), as CGPs encontram-se no epiblasto, mais precisamente no centro da zona pelúcida. As células são deslocadas até ao hipoblasto. Durante a formação da linha primitiva as CGPs são transferidas para uma região extraembrionária, anterior à linha primitiva em desenvolvimento, denominada crescente germinal. É na zona do crescente germinal que estas células se incorporam na rede vascular aí formada, durante os estádios HH8-10, migrando pelo sistema vascular do embrião, até atingirem as futuras gónadas entre os estádios HH15-19. No entanto alguns destes estudos foram realizados usando marcadores não específicos para esta linha celular, nomeadamente o stage specific embryonic antigen 1 (SSEA-1). Neste trabalho avaliámos a especificidade do marcador SSEA-1 nestas células. Usámos como marcador mais fidedigno o anticorpo contra VASA, proteína que sabemos estar envolvida na identificação destas células em diferentes grupos taxonómicos ao longo da evolução (incluíndo o grupo Gallus gallus). Ao longo nosso trabalho, o marcador SSEA-1 não se revelou específico desta linha celular, sobretudo em estádios mais precoces. Esta observação levou-nos à necessidade de caracterizar a posição destas células no embrião de galinha, em diferentes estruturas embrionárias ao longo de vários estádios de desenvolvimento, a fim de perceber melhor o seu processo de migração. Ao analisar imunohistoquimicamente embriões entre os estádios de desenvolvimento HH5-19, deparámos com a presença destas células, em estádios HH8-13, numa estrutura nunca antes referida no seu processo de migração: o âmnio/córion. Para compreender se o âmnio e o córion têm um papel na migração das CGPs, cultivámos embriões de galinha pelo método de cultura “cornish pasty”. Este método de cultura in vitro, permite o correcto desenvolvimento do embrião com excepção do desenvolvimento da somatopleura e da prega amniótica, que devido à ausência de pressão da cabeça sobre os tecidos adjacentes, não consegue elevar-se sobre o embrião. Desta forma, a somatopleura continua o seu desenvolvimento à volta da área extraembrionária. A análise imunohistoquímica destes embriões, permitiu concluir que as CGPs no estádio HH10 se encontram no local onde seriam encontradas num embrião com desenvolvimento in ovo (localizadas numa posição anterior à cabeça, e na qual, num embrião com desenvolvimento in ovo se elevaria a prega amniótica). No entanto em estádios intermédios (HH13) estas células encontram-se na somatopleura. Verificámos também que a presença destas células nesta estrutura se mantêm em estádios mais avançados (HH17), nos quais é de esperar a presença das CGPs nas futuras gónadas. A partir destas observações concluímos que estas células estão a usar esta estrutura numa parte inicial da sua migração. Ao longo deste trabalho deparámo-nos com lacunas na literatura à cerca do âmnio que, desta forma, encontrámos algumas lacunas na literatura relativamente aos mecanismos inerentes ao seu desenvolvimento. Assim, usando técnicas histológicas tradicionais aliadas a técnicas de live imaging, procedemos à análise do desenvolvimento desta estrutura que pensamos ter um papel importante na migração das CGPs. Concluímos dessa forma que esta estrutura extraembrionária parece ter um desenvolvimento dependente da formação da cabeça embrionária e do proamnio. O proamnion, estrutura diblástica anterior à cabeça, estará a servir de “clip”, possibilitanto que a cabeça “mergulhe” sobre os tecidos subjacentes à mesma, ajudando ao correcto desenvolvimento da prega amniótica mediana pre-axial sobre a cabeça. A integração dos dados obtidos neste trabalho, levou-nos a propor um novo mecanismo de migração para estas células com uma fase transitória de migração através do âmnio/córion. As CGPs, inicialmente presentes no epiblasto e mais tarde deslocadas para o hipoblasto, são depois incorporadas na mesoderme. A mesoderme, que ingressa pela linha primitiva, dará origem à espancnopleura e somatopleura. Estas duas estruturas estão envolvidas na formação do sistema vascular extraembrionário e do âmnio/córion, respectivamente. Assim o nosso modelo considera que as CGPs, presentes na mesoderme, durante a formação da somatopleura e da esplancnopleura, são incorporadas na somatopleura. O nosso modelo não exclui o facto de que algumas destas células poderão ficar na mesoderme que, em conjunto com a endoderme, formará a esplancnopleura e que por essa razão tenham sido identificadas nas ilhas sanguíneas, em estádios precoces do desenvolvimento (HH1O). O facto de as CGPs usarem o âmnio/córion como estrutura transitória na sua migração poderá estar relacionado com o facto de as CGPs, apesar de mais tarde usarem o sistema vascular para se deslocarem até à futura gónada, estarem a evitar os processos envolvidos na vasculogénese e angiogénese que estão a ocorrer ao nível das ilhas sanguíneas. Durante o processo de vasculogénese e angiogénese são recrutados inúmeros sinais químicos e parácrinos que poderiam conduzir a uma alteração da linhagem das CGPs. O âmnio e o córion foram uma das novidades evolutivas mais importantes no decurso da evolução, permitindo a independência de ambientes aquáticos para a reprodução. Permitiram a exploração de uma enorme variabilidade de nichos terrestres. No entanto, parece-nos que além da sua função como protector da dissecação em amniotas, esta estrutura poderá estar a ser usada em outros processos embrionários. Este trabalho veio assim redefinir o papel do âmnio/córion na migração das CGPs. Esta estrutura extra-embrionária, constitui um suporte com características que permitem a manutenção da estaminidade celular, como tem sido descrito recentemente. Este trabalho demonstra assim a necessidade de um estudo mais aprofundado deste anexo embrionário que poderá ter mais aplicações, na área das células estaminais, do que inicialmente se esperava, sendo o facto de as CGPs estarem a usá-lo no seu processo de migração um indicador revelador dessa capacidade de manutenção da estaminidade celular

Primordial germ cells and amnion development in the avian embryo

Primordial germ cells (PGCs) are the progenitors of the gametes, responsible for transmitting genetic information from generation to generation. Although there is a long history of gamete biology research, there is still a lot to be learned about many of the mechanisms underlying germ cell development. This dissertation describes and discusses the dynamics of PGCs in the chicken, with a focus on their migration to the gonads and meiosis that takes place when PGCs are already settled there. We also discussed the advantages of using the avian model in epithelial ovarian cancer research. Moreover, we revisited an often overlooked model for amniogenesis in which the proamnion plays a crucial role.UBL - phd migration 201

Lymphangiogenesis and angiogenesis during human fetal pancreas development

Background: The complex endocrine and exocrine functionality of the human pancreas depends on an efficient fluid transport through the blood and the lymphatic vascular systems. The lymphatic vasculature has key roles in the physiology of the pancreas and in regulating the immune response, both important for developing successful transplantation and cell-replacement therapies to treat diabetes. However, little is known about how the lymphatic and blood systems develop in humans. Here, we investigated the establishment of these two vascular systems in human pancreas organogenesis in order to understand neovascularization in the context of emerging regenerative therapies. Methods: We examined angiogenesis and lymphangiogenesis during human pancreas development between 9 and 22 weeks of gestation (W9-W22) by immunohistochemistry. Results: As early as W9, the peri-pancreatic mesenchyme was populated by CD31-expressing blood vessels as well as LYVE1- and PDPN-expressing lymphatic vessels. The appearance of smooth muscle cell-coated blood vessels in the intra-pancreatic mesenchyme occurred only several weeks later and from W14.5 onwards the islets of Langerhans also became heavily irrigated by blood vessels. In contrast to blood vessels, LYVE1- and PDPN-expressing lymphatic vessels were restricted to the peri-pancreatic mesenchyme until later in development (W14.5-W17), and some of these invading lymphatic vessels contained smooth muscle cells at W17. Interestingly, between W11-W22, most large caliber lymphatic vessels were lined with a characteristic, discontinuous, collagen type IV-rich basement membrane. Whilst lymphatic vessels did not directly intrude the islets of Langerhans, three-dimensional reconstruction revealed that they were present in the vicinity of islets of Langerhans between W17-W22. Conclusion: Our data suggest that the blood and lymphatic machinery in the human pancreas is in place to support endocrine function from W17-W22 onwards. Our study provides the first systematic assessment of the progression of lymphangiogenesis during human pancreatic development

Meiotic wave adds extra asymmetry to the development of female chicken gonads

Development of female gonads in the chicken is asymmetric. This asymmetry affects gene expression, morphology, and germ cell development; consequently only the left ovary develops into a functional organ, whereas the right ovary remains vestigial. In males, on the other hand, both gonads develop into functional testes. Here, we revisited the development of asymmetric traits in female (and male) chicken gonads between Hamburger Hamilton stage 16 (HH16) and hatching. At HH16, primordial germ cells migrated preferentially to the left gonad, accumulating in the left coelomic hinge between the gut mesentery and developing gonad in both males and females. Using the meiotic markers SYCP3 and phosphorylated H2AFX, we identified a previously undescribed, pronounced asymmetryc meiotic progression in the germ cells located in the central, lateral, and extreme cortical regions of the left female gonad from HH38 until hatching. Moreover, we observed that-in contrast to the current view-medullary germ cells are not apoptotic, but remain arrested in pre-leptotene until hatching. In addition to the systematic analysis of the asymmetric distribution of germ cells in female chicken gonads, we propose an updated model suggesting that the localization of germ cells-in the left or right gonad; in the cortex or medulla of the left gonad; and in the central part or the extremities of the left cortex-has direct consequences for their development and participation in adult reproduction

POSIBLES INTERACCIONES MEDICAMENTOSAS EN UN HOGAR DE ANCIANOS DEL MUNICIPIO DE SÃO GOTARDO / MINAS GERAIS

Com o avanço da idade cronológica, surgem inúmeras patologias, fazendo dos idosos os maiores usuários de medicamentos, tornando-os vulneráveis aos efeitos adversos e às interações medicamentosas, praticando assim a polifarmácia. O objetivo geral deste trabalho foi avaliar as possíveis interações dos medicamentos em uso pelos idosos que residem em um Lar dos Idosos no município de São Gotardo/MG, identificando as possíveis interações medicamentosas graves. Bem como, poderá fornecer material técnico à equipe multiprofissional para possíveis intervenções na terapia medicamentosa, resultando na melhoria da qualidade de vida dos idosos. Foi realizado um estudo das medicações utilizados pelos idosos residentes nessa instituição, através da autorização da mesma, sendo avaliado 34 prescrições, de ambos sexos, com idade superior a 60 anos. Este trabalho consta Parecer CONEP n° 4.614.230. Foram encontradas 59 interações medicamentosas potencialmente graves. As classes de fármacos mais envolvidas em interações medicamentosas foram a dos medicamentos que agem no sistema nervoso central e no sistema cardiovascular. Os resultados implicam em cuidados especiais por parte do farmacêutico, juntamente com a equipe de saúde, a fim de instituir uma farmacoterapia adequada, para minimizar a ocorrência de eventos adversos potencialmente graves.With the advancement of chronological age, numerous pathologies appear, making the elderly the largest drug users, making them vulnerable to adverse effects and drug interactions, thus practicing polypharmacy. The general objective of this study was to evaluate the possible drug interactions used by the elderly who live in a Home for the Elderly in the city of São Gotardo/MG, identifying possible serious drug interactions. As well as providing technical material to the multidisciplinary team for possible interventions in drug therapy, resulting in an improvement in the quality of life of the elderly. A study of the medications used by the elderly residents of this institution was carried out, with the authorization of the same, being evaluated 34 prescriptions, of both genders, aged over 60 years. 59 potentially serious drug interactions were found. The drug classes most involved in drug interactions were drugs that act on the central nervous system and the cardiovascular system. The results imply special care on the part of the pharmacist, together with the health team, in order to institute an adequate pharmacotherapy to minimize the occurrence of potentially serious adverse events.Con el avance de la edad cronológica, aparecen numerosas patologías, convirtiendo al anciano en el mayor consumidor de drogas, haciéndolo vulnerable a efectos adversos e interacciones farmacológicas, practicando así la polifarmacia. El objetivo general de este estudio fue evaluar las posibles interacciones medicamentosas en uso por los ancianos residentes en un Hogar de Ancianos en la ciudad de São Gotardo / MG, identificando posibles interacciones medicamentosas graves. Así como proporcionar material técnico al equipo multidisciplinar para posibles intervenciones en farmacoterapia, que redunden en una mejora en la calidad de vida de las personas mayores. Se realizó un estudio de los medicamentos utilizados por los ancianos residentes de esta institución, con la autorización del mismo, evaluándose 34 prescripciones, de ambos sexos, mayores de 60 años. Este trabajo está incluido en la Opinión CONEP No. 4.614.230. Se encontraron 59 interacciones farmacológicas potencialmente graves. Las clases de fármacos más implicadas en las interacciones farmacológicas fueron los fármacos que actúan sobre el sistema nervioso central y el sistema cardiovascular. Los resultados implican un cuidado especial por parte del farmacéutico, junto con el equipo de salud, a fin de instituir una farmacoterapia adecuada para minimizar la ocurrencia de eventos adversos potencialmente graves

Dissertações

Resumos de dissertações defendidas na Universidade Lusófona, na área das ciências da Educação

Guidelines on the diagnosis and treatment for acute promyelocytic leukemia: Associacao Brasileira de Hematologia, Hemoterapia e Terapia Celular Guidelines Project: Associacao Medica Brasileira - 2013

Universidade Estadual de CampinasUniversidade de São PauloUniversidade Federal de São Paulo (UNIFESP)Universidade de BrasiliaUniversidade Federal do Rio Grande do SulUniversidade Federal de Minas GeraisUniversidade Federal de PernambucoUNIFESP, EPMSciEL

Development of the follicular basement membrane during human gametogenesis and early folliculogenesis

Background: In society, there is a clear need to improve the success rate of techniques to restore fertility. Therefore a deeper knowledge of the dynamics of the complex molecular environment that regulates human gametogenesis and (early) folliculogenesis in vivo is necessary. Here, we have studied these processes focusing on the formation of the follicular basement membrane (BM) in vivo. Results: The distribution of the main components of the extracellular matrix (ECM) collagen IV, laminin and fibronectin by week 10 of gestation (W10) in the ovarian cortex revealed the existence of ovarian cords and of a distinct mesenchymal compartment, resembling the organization in the male gonads. By W17, the first primordial follicles were assembled individually in that (cortical) mesenchymal compartment and were already encapsulated by a BM of collagen IV and laminin, but not fibronectin. In adults, in the primary and secondary follicles, collagen IV, laminin and to a lesser extent fibronectin were prominent in the follicular BM. Conclusions: The ECM-molecular niche compartimentalizes the female gonads from the time of germ cell colonization until adulthood. This knowledge may contribute to improve methods to recreate the environment needed for successful folliculogenesis in vitro and that would benefit a large number of infertility patients

Dental and composite resin discoloration induced by different hydraulic calcium silicate-based cements: two-year in vitro assessment

Few long-term studies assess the discoloration induced by hydraulic calcium silicate-based cement on dental structures. In addition, as far as we know, no long-term study has assessed the discoloration induced by these cement on composite resin. Objective: This in vitro study aimed to assess, during a period of two years, the discoloration potential of different hydraulic calcium silicate-based cements (hCSCs) on the enamel/dentin structure and composite resin restoration. Methodology: A total of 40 enamel/dentin discs were obtained from bovine incisors, and 40 composite resin discs (10 mm in diameter × 2 mm thick) were fabricated. A 0.8 mm-deep cavity was made in the center of each disc and filled with the following hCSCs (n=10): Original MTA (Angelus); MTA Repair HP (Angelus); NeoMTA Plus (Avalon); and Biodentine (Septodont). An initial color measurement was performed (T0 - baseline). After 7, 15, 30, 45, 90, 300 days, and two years, new color measurements were performed to determine the color (ΔE00), lightness (ΔL’), chroma (ΔC’), hue differences (ΔH’), and whiteness index (WID). Results: For enamel/dentin, the ΔE00 was significant among groups and periods (p<0.05). NeoMTA Plus had the greatest ΔE00. The NeoMTA Plus group had the greatest ΔE00 after two years for composite resin. Significant reduction in lightness was observed for all groups after two years (p<0.05). The most significant WID values were observed after 30 days for Biodentine (enamel/dentin) and MTA Repair HP groups (composite resin) (p<0.05). Conclusions: The hCSCs changed the colorimetric behavior of both substrates, leading to greater darkening over time. The Bi2O3 in the Original MTA seems relevant in the short periods of color change assessment